RAPORT FINAL DE CERCETARE

SEPTEMBRIE 2006

 

Contract nr. 333/2004

Titlul proiectului: "Studii privind efectul vaccinului stafilococic corpuscular folosit in tratamentul periodontitei"

Director proiect Dr. Ion Bogdan Teodor Georgescu

Etapa V. Corelarea rezultatelor obtinute si evaluarea eficacitatii tratamentului.

Activitate 5.1. Prelucrarea statistica a datelor

Activitate 5.2. Redactarea raportului final.

 

Introducere

Periodontita este o boala inflamatorie cronica caracterizata prin infiltratia mononucleara a tesutului gingival urmata de distructia tesutului conjunctiv si alveolar. Studiile epidemiologice arata ca 5-20% din populatie sufera de forme severe de periodontita. Desi declansarea bolii este determinata de germenii bacterieni orali progresia si severitatea bolii este determinata de raspunsul imun al gazdei.

Au fost estimate aproximativ 500 de specii bacteriene ca apartinand florei cavitatii bucale, in majoritate fiind comensale si o mica parte sunt considerate ca patogeni oportunisti putind fi implicati in infectii orale sau sistemice. Folosirea metodelor de biologie moleculara au aratat marea diversitate bacteriana exitenta la nivelul placii subgingivale. Dintre bacteriile izolate din microbiota subgingivalacu rol in periodontita fac parte si cei din genul Staphylococcus precum si germenii anaerobi dintre care cei mai frecventi incriminati sunt : Porphyromonas gingivalis, Actinobacillus actynomicetemcomitans, Fusobacterium nucleatum, Bacteroides gingivalis etc.

Alaturi de agentul cauzal bacterian, un rol important in evolutia bolii este atribuit raspunsului imun al organismului. Numeroase studii au evidentiat prezenta limfocitelor T dar nu este inca elucidat daca raspunsul imun este de tip Th1 sau Th2. Activarea raspunsului imun mediat celular de catre bacteriile si produsii lor poate fi directionat catre un raspuns de tip Th2 acompaniat de o reactie inflamatorie non-citotoxica sau catre un raspuns inflamator sever de tip Th1. Studiile pe polimorfonucleare (PMN) au cautat corelatii intre prezenta infiltratului cu aceste celule si progresia bolii.

Terapia actuala a periodontitei urmareste supresia sau eradicarea patogenilor periodontali cu mentinerea postratament a florei comensale. Pe langa antibioterapie o modalitate de abordare terapeutica a periodontitei o reprezinta vaccinarea. Studii anterioare efectuate au aratat eficacitatea tratamentului cu vaccin stafilococic corpuscular in tratamentul periodontitei pe baza rezultatelor clinice.

In acest studiu am am urmarit investigarea bacteriologica si imunologica a efectului vaccinului stafilococic corpuscular in tratamentul periodontitei la un grup de pacienti cu periodontita.

Materiale si metode

Subiecti. Au fost luati in studiu 15 subiecti cu parodontite, 5 subiecti de sex masculin si 10 subiecti de sex feminin cu varste cuprinse intre 35-70 ani si 8 donatori clinic sanatosi care au au constituit lotul martor. Examinarile efectuate la pacienti au fost realizate inainte si dupa terapia cu Vaccin stafilococic D (produs comercial, INCDMI ‘Cantacuzino’).

Tehnici microbiologice. Recoltarea produsului patologic din punga periodontala de la pacienti s-a efectuat in dublu, cu ansa bacteriologica si cu mesa. Din produsul patologic recoltat au fost pregatite frotiuri colorate Gram. Identificarea germenilor din genul Staphylococcus si a cocilor gram pozitivi aerobi sau facultativ anaerobi a fost realizata prin insamantarea produsului patologic pe medii selective( mediile hiperclorurat solid si hiperclorurat lichid) si pe mediu agar nutritiv cu adaos de sange de berbec. Verificarea puritatii culturii a fost efectuata pe frotiuri colorate gram efectuate din o colonie izolata. Identificarea a fost efectuata prin testul catalazei pentru diferentierea Fam. Micrococaceae de Fam. Streptococaceae, stafilococii sunt catalazo pozitivi. Pe baza caracteristicilor de cultivare (producerea de pigment si a hemolizei) si a testul coagulazei s-a facut diferentierea S.aureus de alte specii de stafilococi coagulazo negativi. Pentru diferentierea speciilor de stafilococ au fost utilizate sistemul de galerii API STAPH. Diferitele teste ale galeriei se prezinta sub forma deshidratata, reconstituirea lor se face prin adaugarea in fiecare tub de API STAPH a mediului insamantat cu fiecare tulpina de studiat. Incubarea se face la 35 – 37şC timp de 18 – 24 ore. Citirea si interpretarea sunt realizate folosind informatiile din ghidul ce insoteste galeria. Interpretarea este facilitata prin utilizarea Catalogului Analitic API STAPH. Pentru identificare a germenilor anaerobi insamantarea a fost efectuata in conditii de anaerobioza pe medii uzuale neselective (bulion VF cu acid tioglicolic regenerat) si pe medii selective (geloza sange, Nagler si bila cu antibiotice). Incubare la 37° C 24-72 ore. Coloniile caracteristice s-au repicat in mediul VF lichid si s-au incubat la 37^oC pana la aparitia cresterii bacteriene. S-a facut controlul puritatii tulpinii (frotiu coloratie Gram) si al caracterului strict anaerob (insamantare pe placi cu mediu geloza, sange, incubare in anaerobioza cu lipsa cresterii microbiene la 24-48 h). Tulpinile strict anaerobe au fost supuse diagnosticului biochimic folosind galerii API 20 A pentru identificare germeni anaerobi.

Tehnici si metode imunologice Recoltarea sangelui venos periferic s-a efectuat pe vacutainere specifice fara anticoagulant pentru ser si cu anticoagulant (Na₂-EDTA-pentru citometrie in flux, si heparina sodica 14 UI/mL sange recoltat- testul de chemiluminometrie).

Imunodifuzia radiala simpla Mancini (IDRS) a fost utilizata in determinarea cantitativa a: IgG, IgA, IgM, complementului C3 si proteinei C reactiva (PCR) fiind efectuata pe Imunoplaci IC ((Institutul "Cantacuzino" Bucuresti) corespunzatoare fiecarei proteine. In godeurile imunoplacilor se introduc 5 ྒྷL din serul uman de referinta (SUR) sau serul de referinta PCR si serurile de analizat diluate sau nu in ser fiziologic si se icubeaza la 37⁰C. Timpul necesar incubarii, dilutiile in care sunt utilizate serurile pentru determinarile urmarite sunt furnizate in tabelul 1.

Tabelul 1. Timpul si dilutia la care se determina pe imunoplaci IC proteinele serice. 

Proteina	Ser de referinta dilutie	Proba Dilutie	Timp de incubare la 370C (ore)
Ig G	1/4 SUR	Ľ	24
Ig A	1/4 SUR	Ľ	24
Ig M	1/2 SUR	˝	48
Complement C3	1/2 SUR	˝	24
Proteina C reactiva	CRP nediluat	Nediluat	24

Dupa un timp de incubare diferit, in functie de tipul imunoplacii, cu rigla gradata transparenta se citesc diametrele inelelor de precipitare de pe imunoplaca si se face corespondenta intre diametrul obtinut (mm) si cantitate (mg/dL sau UI/mL) din tabelul furnizat in instructiunile de lucru corespunzatoare determinarii efectuate. Valorile normale pentru parametri urmariti sunt furnizate in tabelul 2.

Tabelul 2. Valorile serice normale ale proteinelor determinate

Proteine	mg/dL
Ig G	800-2000
Ig A	90-450
Ig M	60-280
Complement C3	50-120
Proteina C reactiva	1

Obtinerea PMN fost efectuata prin separarea celulelor mononucleare si a granulocitelor din sangele periferic recoltat pe heparina prin centrifugare in gradient de densitate Ficoll-Hipaque urmata de liza cu NH₄Cl ahematiilor si indepartarea acestora precum si a celulelor moarte din sedimentul celular. Viabilitatea celulara determinata prin testul excluziei cu eozina care a fost peste 95%.

Testul de chemiluminometrie Formarea speciilor reactive de oxigen (ROS) de catre granulocitul PMN este asociata cu emisia de energie luminoasa. Aceasta emisie luminoasa poate fi intensificata cu ajutorul luminolului si convertita de catre un chemiluminometru in semnal electric, rezultatele fiind exprimate in mV. Inregistrarea datelor s-a facut pe un interval de 30 minute citirea intensitatii luminoase a fiecarei probe efectuandu-se la un interval de 2 minute. Protocolul de lucru a fost urmatorul : 1.PMN nestimulate, PMN stimulate cu zimozan opsonizat (ZO), PMN stimulate cu ConcanavalinaA (ConA). Citirea speciilor reactive de oxigen a fost realizata la un chemiluminometru BioOrbit LKB 1251 cuplat la un calculator cu program specializat de inregistrare (Phagotest). Rezultatele au fost exprimate ca indici de stimulare procentuali (IS%) calculati dupa formula : maximul intensitatii luminoase inregistrate la proba stimulata/ maximul intensitatii luminoase inregistrate la proba nestimulata x 100.

Tehnica de citometrie in flux Identificarea seturilor si subseturilor limfocitare din sangele periferic recoltat pe Na2-EDTA a fost efectuata prin utilizarea trusei Simultest IMK-Plus (anticorpi monoclonali : anti-CD3/CD4, anti-CD3/CD8, anti-CD3/CD19, anti-CD3/CD16+CD56, anti-CD3/HLADR). Citirea si analiza probelor a fost realizata cu ajutorul citometrului in flux FACSCalibur (Becton-Dickinson), in programul automat Simulset.

Prelucrarea statistica Variabilele cantitative au fost definite ca medii aritmetice si deviatii standard. Analiza multivarianta descriptiva a folosit tehnici de comparare a mediilor variabilelor aleatoare cantitative (testul T-Student). Pentru toate procedurile utilizate pragul de semnificatie statistica a fost de minimum 95% (p 0,05).

Rezultate

Izolarea si identificarea bacteriilor.

Examinarea bacteriologica a produselor biologice recoltate din punga periodontala de la cei 15 pacienti studiati a fost efectuata inainte si dupa instituirea tratamentului cu vaccin stafilococic corpuscular. Nu au existat diferente intre probele recoltate cu ansa sau mesa de la acelasi pacient. In tabelul 3. sunt prezentate rezultatele examinarilor microbiologice.

Tabelul 3. Speciile bacteriene izolate din punga periodontala la subiectii luati in studiu inainte si dupa tratamentul cu vaccin stafilococic corpuscular.

Nr. Crt.	Inainte de	Dupa
	administrarea vaccinului stafilococic
1	Porphyromonas asacharolitica Peptostreptococcus anaerobius	Staphylococcus epidermidis
2	Bacteroides fragilis	Nu s-a dezvoltat flora bacteriana
3	Staphylococcus warneri	Staphylococcus warneri
4	Staphylococcus aureus	Nu s-a dezvoltat flora bacteriana
5	Fusobacterium nucleatum Staphylococcus epidermidis	Fusobacterium nucleatum
6	Nu s-a dezvoltat flora bacteriana	Nu s-a dezvoltat flora bacteriana
7	Staphylococcus chromogenes	Nu s-a dezvoltat flora bacteriana
8	Staphylococcus epidermidis Veillonella parvula	- Veillonella parvula
9	Staphylococcus epidermidis Bacteroides fragilis	Staphylococcus epidermidis Bacteroides fragilis
10	Staphylococcus capitis	Nu s-a dezvoltat flora bacteriana
11	Bifidobacterium sp. Stapylococcus aureus	Bifidobacterium sp.
12	Bifidobacterium sp. Streptococcus viridans	Bifidobacterium sp. Streptococcus viridans
13	Streptococcus viridans	Streptococcus viridans
14	Bifidobacterium sp. Staphylococcus epidermidis	Bifidobacterium sp. Staphylococcus epidermidis
15	Fusobacterium mortiferum Staphylococcus epidermidis	Fusobacterium mortiferum Streptococcus viridans

La un pacient nu s-a dezvoltat flora nici inainte nici dupa administrarea tratamentului. Inainte de administrarea vaccinului stafilococic la majoritatea pacientilor (57%) au fost identificati doi germeni fie strict anaerobi fie in asociere cu coci gram pozitivi aerobi facultativ anaerobi. Bacterii din genul Staphylococcus spp. au fost izolate de la 9 pacienti (64%) fie singuri fie in asociere cu bacterii anaerobe. Staphylococcus aureus a fost identificat la 2 subiecti si la un subiect a fost indentificat numai Streptococcus viridans. Tot la 9 dintre pacienti (64%) inainte de tratament au fost izolate bacterii strict anaerobe in majoritatea cazurilor in asociere cu bacterii facultativ anaerobe. Dupa administrarea terapiei cu vaccin stafilococic s-a obervat reducerea florei bacteriene izolate din punga parodontala cu absenta devoltarii florei din specimenele izolate la 5 dintre pacienti (33%). Staphylococcus aureus nu a mai fost izolat dupa terapie. La 6 dintre subiecti (40%) flora izolata dupa vaccinare a fost identica cu cea anterioara iar la unul dintre pacienti flora identificata a fost diferita de cea anterioara.

Explorarea unor parametri ai imunitatii mediate umoral si celular

La cei 15 pacienti luati in studiu s-au analizat valorile inainte si dupa administrarea vaccinului stafilococic corpuscular pentru urmatorii parametri ai imunitatii mediate umoral: proteina C reactiva (PCR), fractiunea C3 a complementului, IgM, IgG, IgA (tabelul 4).

Tabelul 4. Parametrii imunitatii umorale investigati, inainte si dupa tratamentul imunomodulator (vaccin stafilococic) la pacientii cu periodontita luati in studiu.

 

La n

Nr. crt.	Momentul determinarii (relativ la vaccinare)	CRP (mg/dl)	C3 (mg/dl)	IgM (mg/dl)	IgG (mg/dl)	IgA (mg/dl)
1.	Inainte	<1	72	70,4	1728	302,4
	Dupa	<1	84	65,6	1792	145,6
2.	Inainte	<1	88	88	1600	145,6
	Dupa	<1	92	80	1792	235,2
3.	Inainte	<1	80	75,2	1088	168
	Dupa	<1	84	75,2	1280	145,6
4.	Inainte	<1	92	160	1472	145,6
	Dupa	<1	80	188,8	1408	140
5.	Inainte	<1	108	128	1344	190,4
	Dupa	<1	108	144	1344	156,8
6	Inainte	<1	92	152	1408	246.4
	Dupa	<1	104	152	1536	246.4
7	Inainte	<1	160	169.6	1728	156.8
	Dupa	<1	160	169.6	1728	151.2
8	Inainte	<1	68	60.8	1216	168
	Dupa	<1	60	60.8	1024	168
9	Inainte	<1	84	169.6	1664	224
	Dupa	<1	84	169.6	1888	224
10	Inainte	<1	92	104	1280	201.6
	Dupa	<1	92	104	1536	201.6
11	Inainte	ND	68	120	1408	212,8
	Dupa	ND	68	120	1344	212,8
12	inainte	ND	136	169,6	1024	156,8
	dupa	ND	108	136	1152	145,6
13	inainte	ND	80	169,6	1152	140
	dupa	ND	68	169,6	960	128,8
14	inainte	ND	68	96	960	201,6
	dupa	ND	68	104	896	224
15	inainte	ND	68	144	896	188
		ND	76	144	1152	224

ici unul din subiectii investigati nu a fost decelata proteina C reactiva. Fractiunea C3 a complementului a fost peste limita normala numai la unul dintre subiectii investigati, valoarea mare a acestui parametru mentinandu-se si dupa administrarea vaccinului stafiococic. Titrul imunoglobulinelor din clasele IgM, IgG la subiectii investigati au aratat valori in limite normale. La un singur subiect a fost o valoare peste limita normala a IgA care revenit la normal dupa terapie. De semnalat ca nu exista modificari semnificative ale valorilor acestor parametri dupa tratamentul cu vaccin stafilococic.

 La pacientii luati in studiu a fost masurata capacitatea de eliberare a SRO atat inainte cat si dupa administrarea vaccinului stafilococic rezultatele fiind exprimate ca indici de stimulare procentuali. Rezultatele au aratat o scadere a mediei eliberarii SRO de catre granulocitele PMN stimulate cu ZO inainte de tratament comparativ cu valorile lotului de control dar nesemnificativa statistic (p0,08). In schimb media indicelui de stimulare la ConA a fost semnificativ crescut (p0,015) comparativ cu lotul de control. Dupa administrarea vaccinului stafilococic D la pacientii luati in studiu, masurarea nivelelor de eliberare a SRO de catre PMN au fost semnificativ mai scazute in urma stimularii (ZO p0,003; ConA p0,002) comparativ cu valorile anterior avute. Rezultatele sunt prezentate in figura 1.

Figura 1. Respiratia oxidativa a granulocitelor PMN stimulate in vitro cu ZO si ConA determinata inainte si dupa administrarea vaccinului stafilococic corpuscular.

La subiectii investigati prin tehnica de citometrie in flux au fost analizate populatiile si subpopulatiile limfocitare din sangele periferic atat inainte cat si dupa administrarea vaccinului stafilococic corpuscular. Rezultatele evaluate procentual si in valoare absoluta nu au evidentiat modificari ale valorilor seturilor si subseturilor limfocitare prin terapie (Tabel 5). La 6 dintre subiectii investigati au fost detectate celule NKT in ambele determinari efectuate (Tabel 5). Raportul CD4/CD8 a fost supraunitar in intervalul de valori normale atat inainte cat si dupa adminstrarea vaccinului stafilococic corpuscular. (Tabel 5).

Tabelul 5. Valorile procentuale ale markerilor de suprafata care caracterizeaza subpopulatiile limfocitare izolate din sangele periferic la subiectii investigati.

Nr.crt.	Limfocite	Marker	Inainte	Dupa
			administrarea vaccinului stafilococic % (Medie DS)
1	T	CD3+	779	769
2	B	CD19+	63	73
3	Tc/s	CD8+	377	367
4	Th	CD4+	507	506
5	T activate	CD3+/HLA-DR+	85	95
6	NK	CD3-/CD16-56+	199	2110
7	NKT	CD3+/CD16-56+ (6 subiecti)	124	103
Raport CD4/CD8			1,380,39	1,460,45

Discutii

Periodontita este o inflamatie cronica declansata de o infectie bacteriana a carei terapie frecvent se asociaza in timp cu rezistenta la antibiotice. Astfel, o modalitate de abordare terapeutica a bolii o reprezinta vaccinarea cu vaccin stafilococic corpuscular D, alcatuit din 15 tulpini selectate din specia Staphylococcus aureus. Studii clinice anterior efectuate au evidentiat eficacitatea acestei terapii dupa o schema terapeutica originala.

La pacientii investigati, examenul microbiologic efectuat din punga parodontala inainte de vaccinare a aratat detectarea la majoritatea subiectilor a doi germeni bacterieni in majoritatea anaerobi in asociere cu germeni aerobi . S-a observat o frecventa crescuta a stafilococilor coagulazo-negativi si in doua cazuri a fost identificat Staphylococcus aureus. Flora anaeroba detectata a fost de asemenea identificata in majoritatea cazurilor din genul Fusobacterium Bacteroides, Bifidobacterium, Porphyromonas, Peptostreptococcus, Veillonella acestia fiind si cei mai descrisi in literatura. Dintre cocii gram pozitivi aerobi a fost identificat Streptococcus viridans. Aceste date arata o frecventa crescuta a bacteriilor din genul Staphylococcus sp. la subiectii investigati date anterioare aratand o frecventa crescuta a bacteriilor Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia si Fusobaterium nucleatum.

Administrarea terapiei cu vaccin stafilococic a evidentiat reducerea florei bacteriene izolate din punga parodontala. Staphylococcus aureus nu a mai fost izolat iar la 33% din pacienti nu a mai fost izolata flora anterior detectata. Totusi, la 40% din pacienti flora izolata dupa vaccinare a fost identica cu cea anterioara (Tabelul 3).

La nici unul dintre subiecti nu a fost detectata PCR. Determinarile fractiunii C3 a complementului au fost in limita valorilor normale atat inainte cat si dupa administrarea vaccinului stafilococic exceptie facand un singur subiect. De asemenea, imunoglobulinele din clasele IgM, IgG si IgA la subiectii investigati au aratat valori in limite normale, fara modificari semnificative ale valorilor acestor parametri dupa tratamentul cu vaccin stafilococic. La un singur pacient a fost detectata inainte de tratament o valoare crescuta a IgA serice care a revenit la normal dupa tratament (Tabelul 4).

Determinarea respiratiei oxidative a granulocitelor PMN prin tehnica chemiluminometriei dupa stimulare cu ZO, a aratat scaderea statistic semnificativa a eliberarii ROS dupa vaccinare comparativ cu valorile anterior avute (ZO p0,003). Desi fara semnificatie statistica valoarea medie a eliberarii ROS de catre granulocitele PMN dupa stimulare cu ZO a fost mai scazuta decat valorile obtinute la lotul de control (p0,08) (Figura 1).

Inainte de vaccinare, stimularea in vitro a eliberarii SRO de catre granulocitele PMN stimulate cu ConA a aratat un indice mediu de eliberare semnificativ crescut (p0,015) comparativ cu lotul de control si care a scazut semnificativ dupa administrarea vaccinului stafilococic corpuscular (ConA p0,002) dupa cum se vede in figura 1. Aceste rezultate ar putea sugera existenta unei disfunctii la nivelul receptorilor Fc de pe suprafata granulocitelor in cazul pacientilor cu periodontita si o sensibilitate crescuta la actiunea lectinei ConA.

Imunofenotiparea populatiilor si subpopulatiilor limfocitare din sangele periferic la subiectii investigati efectuata inainte si dupa administrarea vaccinului stafilococic corpuscular nu arata modificari semnificative nici ca valori procentuale nici in valori absolute (Tabelul 5). Raportul CD4/CD8 nu a suferit modificari semnificative dupa administrarea vaccinului. Aceste rezultate nu evidentiaza un status imunosupresat la acesti pacienti.

 

Concluzii

La pacientii investigati au fost izolati atat germeni anaerobi cat si aerobi, acestia fiind descrisi si in literatura de specialitate ca implicati in parodontopatii.

Ca o particularitate, este frecventa crescuta a bacteriilor din genul Staphylococcus sp.

Administrarea vaccinului corpuscular stafilococic a determinat reducerea florei bacteriene anterior detectata iar S. aureus nu a mai fost identificat.

In cazul subiectilor la care s-au identificat bacterii anaerobe tratamentul cu vaccin stafilococic nu a influentat flora bacteriana diagnosticata.

Explorarea unor parametri ai imunitatii umorale si celulare la pacientii cu periodontita a aratat:

Absenta proteinei C reactive ca marker de inflamatie acuta

Administrarea vaccinului stafilococic nu modifica valorile claselor de imunoglobuline IgG, IgA, IgM, determinate si a fractiunii C3 a complementului.

Indicele mediu de eliberare a SRO de catre PMN stimulate in vitro cu ZO a fost semnificativ mai scazut dupa vaccinare (ZO p0,003)

Anterior vaccinarii indicele de eliberare a SRO de catre PMN stimulate cu ConA a fost crescut semnificativ comparativ cu valoarea medie obtinuta dupa vaccinare (p0,002) sau comparativ cu controlul (p0,015) 

Procentele populatiilor si subpopulatiilor limfocitare obtinute din sangele periferic precum si a raportului CD4/CD8 nu au fost influentate de vaccinare.